人血清抗胰蛋白酶（α1－AT）的分離純化及鑒定
【目的要求】
1. 掌握α1-AT分離純化各步驟原理、操作及鑒定方法
2. 掌握基本技術(shù)操作及儀器使用
3. 熟悉人血清蛋白質(zhì)的分類方法,α1-AT性質(zhì)
4. 了解生物大分子 制備技術(shù), 分離純化類型
5. 學(xué)會(huì)利用學(xué)過的分離純化方法進(jìn)行基本的科研設(shè)計(jì) 6.練習(xí)研究論文基本寫作
【教學(xué)內(nèi)容一】
分段鹽析法，凝膠過濾法(鹽析法概念及原理，分段鹽析概念，分子篩效應(yīng)，柱層析 基本技術(shù))
【實(shí)驗(yàn)原理】
1. 鹽析法是一種利用蛋白質(zhì)在高鹽溶液中溶解度不同而分離的方法。通過將硫酸銨加入蛋白質(zhì)溶液中，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和，水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在水溶液中的穩(wěn)定性因素去除而沉淀。
2. 通過分段改變鹽類濃度達(dá)到分離目的的方法叫分段鹽析法。
3. 凝膠過濾又稱分子篩層析?；旌衔镫S流動(dòng)相流經(jīng)裝有凝膠作為固定相的層析柱 時(shí)，分子量大的物質(zhì)因不能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而沿凝膠顆粒間的空隙先被洗脫(阻力小,流程短,流速大),分子量小的物質(zhì)因能進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔而受阻滯,流速緩慢,流程長(zhǎng)而后被洗脫,由于流速不同可以把大小不同的分子分開.
【儀器與試劑】
1.離心機(jī)
2.真空泵
3.飽和硫酸銨溶液：稱取767g固體硫酸銨，加入1000ml水中，加熱使之溶解，室溫冷卻后4℃靜置過夜，然后用氨水將pH調(diào)至中性。
4.固體(NH4)2SO45.Sephadex G—256.奈氏試劑7. 雙縮脲試劑8.pH7.4, 0.05M PBS
【步驟】
一 分段鹽析
1.觀看人血清抗胰蛋白酶(α1-AT)的分離及鑒定教學(xué)錄像2.每組量取20ml血清，倒入一干凈燒杯中，緩慢加入飽和硫酸銨20ml，邊加邊攪拌,放入4℃冰箱30分鐘3.從冰箱中取出燒杯，將血清倒入離心管，3000rpm。
離心20分鐘4.將上清倒入一干凈量筒中，記錄體積后，倒入干凈燒杯中，按17.6g/100ml量取固體硫酸銨，緩慢加入上清中，邊加邊攪拌。4℃冰箱放置30分鐘5.將燒杯中液體倒入抽濾器 中，負(fù)壓抽濾6.刮下濾紙上的粗提蛋白，用4ml緩沖液溶解，準(zhǔn)備加樣
二 凝膠過濾層析
1.凝膠柱準(zhǔn)備：(1)連接層析柱(2)夾住出口，加入1/3體積的0.05M pH6.4 PBS，灌膠，待凝膠自然沉降約1cm時(shí)，打開出口，控制流速，60滴/分(3)層析柱填裝完成后，連接下口瓶，調(diào)節(jié)流速，使入口和出口流速相同。
平衡至入口pH值與出口pH值相同(即pH試紙呈色相同)，關(guān)閉出口，等待加樣2.加樣：用吸管吸去膠面以上的緩沖液，立即加入蛋白粗提液(沿管壁緩慢加入)3.打開出口，調(diào)流速15滴/分，待蛋白粗提液完全進(jìn)入膠面，用少量緩沖液清洗管壁。
連接下口瓶4.檢測(cè)：用雙縮脲試劑檢測(cè)洗脫液。待試劑變紅，開始收集，直到試劑不變色停止收集。測(cè)量并記錄收集液的體積，留取1ml樣品(標(biāo)記為G—25樣品)，放入一冷凍管中冰箱凍存;剩余的液體收集入一大試管中，作好標(biāo)記，下次實(shí)驗(yàn)用5.洗去銨鹽：全速洗脫，用奈氏試劑檢測(cè)洗脫液，直到橙色消失為止，回收凝膠
【注意事項(xiàng)】
1.鹽析所用器皿一定要干燥
2.鹽析時(shí)，應(yīng)將飽和硫酸銨或固體硫酸銨加入到血清中，且邊加邊攪拌
3.層析柱上方要留有少量液體，避免使凝膠暴露于空氣中
4.凝膠過濾上樣時(shí)，使樣品沿管壁緩緩流下，勿沖破膠面
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