利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板測定血細(xì)胞數(shù)量及大小

細(xì)胞計(jì)數(shù)是細(xì)胞培養(yǎng) 中常用的技術(shù)，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)可以知曉細(xì)胞的生長狀態(tài)，繪制細(xì)胞生長曲線。細(xì)胞計(jì)數(shù)板是常用細(xì)胞計(jì)數(shù)的器材，具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

一、 目的與要求

1. 掌握用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞直接鏡檢計(jì)數(shù)的方法。

2. 學(xué)習(xí)測量細(xì)胞大小的方法。

二、 實(shí)驗(yàn)原理

動物組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)、血液中血細(xì)胞數(shù)量的變動、許多產(chǎn)品的細(xì)菌 學(xué)檢查、微生物培養(yǎng)等科研、生產(chǎn)和臨床上常常需要檢測細(xì)胞的數(shù)量。測定細(xì)胞數(shù)量的方法有很多種，其中，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的方法樣品用量少，操作簡便、快速、直觀，是一種較常用的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法。

血細(xì)胞計(jì)數(shù)板由一塊長約7.5cm、寬3.5cm的厚玻璃制成，在中部1/3面積處有4條槽，內(nèi)側(cè)兩條槽之間還有1條橫槽相通，在中部構(gòu)成2塊長方形平臺。此平臺比整個(gè)載玻片平面低0.1mm。平臺中部各有一個(gè)計(jì)數(shù)室，每個(gè)計(jì)數(shù)室分九大格，每格邊長1mm，面積為1mm2，蓋上蓋玻片后體積為0.1mm3。

四角的大格被劃分為16個(gè)中方格，一般用作白細(xì)胞、血小板及組織培養(yǎng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)。中央的大方格則由雙線劃分為25個(gè)中方格，每個(gè)中方格面積為0.04mm2，蓋上蓋玻片后體積為0.004mm3，每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，用于紅細(xì)胞、微生物 細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

細(xì)胞的大小和形態(tài)依細(xì)胞種類不同各異，通常血細(xì)胞呈橢圓形或圓球形，直徑在10?m左右，按公式V=4/3?ab2(a為長半徑，b為短半徑)可求出細(xì)胞體積。因此，測量細(xì)胞體積首先要用測微尺測出細(xì)胞的長半徑和短半徑。

常用的測微尺有目鏡測微尺和物鏡測微尺兩種。目鏡測微尺為一塊圓形的薄玻璃片，直徑20-21mm，正好能放入目鏡的鏡筒內(nèi)，其上面刻有不同形式的標(biāo)尺。標(biāo)尺有直線式和網(wǎng)格式兩種，直線式又分為“十”字形和“一”字形兩種。直線式測微尺總長10mm，分為10大格，其上有數(shù)字指示，每一大格又分10小格，共100小格。網(wǎng)格式測微尺常用來測量面積或計(jì)數(shù)。

物鏡測微尺是一種特制的載玻片，其中央有一個(gè)圓圈，圈內(nèi)具有一個(gè)有刻度的標(biāo)尺，為直線式標(biāo)尺，全長1mm，分為10大格，每大格又分10小格，共100小格。每小格長度為0.01mm，即10?m。

由于目鏡測微尺刻度的長度隨物鏡放大倍數(shù)不同而有改變，所以用目鏡測微尺測量細(xì)胞前，首先要測定目鏡測微尺的長度，即使用物鏡測微尺來確定目鏡測微尺刻度的長度，然后再以目鏡測微尺上的刻度作為測量細(xì)胞時(shí)的度量單位。

三、 材料和用具

顯微鏡、載玻片、蓋玻片、血球計(jì)數(shù)板、采血針、干消毒棉球、移液器、試管、滴管、目鏡測微尺、物鏡測微尺、計(jì)數(shù)器。

75%乙醇、紅細(xì)胞稀釋液、白細(xì)胞稀釋液。

四、 操作與觀察

(一) 血細(xì)胞計(jì)數(shù)

1. 用1mL移液器準(zhǔn)確吸取0.38mL白細(xì)胞稀釋液放入一支干凈的小試管內(nèi)，加塞備用。用5mL移液器準(zhǔn)確吸取3.98mL紅細(xì)胞稀釋液，放入一支干凈的中試管內(nèi)，加塞備用。

2. 用消毒棉球蘸75%乙醇消毒左手無名指或耳垂邊緣，待酒精揮發(fā)后用采血針刺入皮膚2-3mm深，讓血液自然流出。

(注意：必須待酒精揮發(fā)后用才能采血，否則流出的血液不成滴，無法吸取。)用干消毒棉球拭去第1滴血液，待第2滴血液成大滴時(shí)，用移液器吸20?l血,再將移液器內(nèi)的血趁出血處尚有血液流出，換1個(gè)槍頭用移液器吸取20?l血液放入盛有紅細(xì)胞稀釋液的試管底部。

輕輕搖振試管1-2min，混勻稀釋的血液，但不可用力過猛，以免產(chǎn)生泡沫。

3. 充液：用擦鏡紙將計(jì)數(shù)板擦干凈，蓋上蓋玻片。用移液器吸取20?l稀釋的血液，滴在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的邊緣，使其依靠毛細(xì)現(xiàn)象自動流入計(jì)數(shù)室內(nèi)。一般應(yīng)一次充液使計(jì)數(shù)室內(nèi)充滿稀釋血液，若經(jīng)幾次充液，易形成氣泡，應(yīng)洗凈計(jì)數(shù)板和蓋玻片，干燥后重新充液。紅細(xì)胞和白細(xì)胞應(yīng)分兩次充液。

4. 計(jì)數(shù)：為防止重復(fù)計(jì)數(shù)和漏數(shù)，計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)遵循一定的順序，對正好壓在格線上的細(xì)胞，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”的原則進(jìn)行計(jì)數(shù)。如果計(jì)數(shù)白細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)各大方格的白細(xì)胞相差8個(gè)以上或計(jì)數(shù)紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)各中方格的紅細(xì)胞相差20個(gè)以上，表明血細(xì)胞分布不均勻，須將稀釋的血液搖勻后再重新充入計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)。

5. 計(jì)算：

(1)白細(xì)胞數(shù)：將四角的四個(gè)大方格內(nèi)數(shù)得的白細(xì)胞總數(shù)乘以50，即得每立方毫米血液內(nèi)的白細(xì)胞總數(shù)。為什么?

(2)紅細(xì)胞數(shù)：將中央大方格的四角和中央共五個(gè)中方格內(nèi)數(shù)得的紅細(xì)胞總數(shù)乘以10000，即得每立方毫米血液內(nèi)的紅細(xì)胞總數(shù)。為什么?

(3)按目前臨床上血細(xì)胞計(jì)數(shù)采用的通用單位，將以上結(jié)果換算為每升血液中各種血細(xì)胞的數(shù)量。

將結(jié)果填入下表： 計(jì)算

次數(shù) 4個(gè)大方格白細(xì)胞數(shù) 5個(gè)中方格紅細(xì)胞數(shù)

1 2 3 4 總數(shù) 1 2 3 4 5 總數(shù)

第1次

第2次

兩次平均總數(shù)

血細(xì)胞計(jì)數(shù) ×109/L ×1012/L

(二) 血細(xì)胞大小的測量

1.安裝與校尺

(1)將物鏡測微尺置于顯微鏡下(刻度面朝上)，用低倍鏡觀察，慢慢調(diào)焦，找到物鏡測微尺刻度。

(2)取下目鏡，旋下目鏡上蓋，將圓形目鏡測微尺放入鏡筒中，旋上目鏡蓋后把目鏡放回鏡筒內(nèi)。

(3)觀察并調(diào)整目鏡測微尺與物鏡測微尺的位置，使兩尺平行，找出兩尺刻度完全重合的兩個(gè)位置，記錄并按下式計(jì)算：

例如，重合兩處之間目鏡測微尺有50小格而物鏡測微尺有68小格，則目鏡測微尺每格長度為68/50×10 = 13.6??m。

(4)以同法用其它物鏡測定目鏡測微尺每格的長度。

2. 測量細(xì)胞體積：取下物鏡測微尺放入保護(hù)盒內(nèi)，換上血涂片，用目鏡測微尺測量紅細(xì)胞和白細(xì)胞的長度與寬度，取其一半為長半徑和短半徑，代入公式求體積。測量完畢后小心取下目鏡測微尺，包裝后放回盒內(nèi)。

3. 計(jì)算：V=4/3?ab2(a為長半徑，b為短半徑)。如果血細(xì)胞是圓球形，其體積V=4/3?R3(R為半徑)。為減少誤差，同一標(biāo)本需測5個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，取其平均值計(jì)算體積。

注意事項(xiàng)：測量細(xì)胞大小的時(shí)候，不影響更換物鏡觀察，如果需要更換物鏡則進(jìn)行測量細(xì)胞大小，則需要重新校準(zhǔn)物鏡。