第一代腺病毒載體重組的常見方法

1.細(xì)胞內(nèi)同源重組

這種方法需要在兩個(gè)DNA分子之間進(jìn)行重組，第一個(gè)DNA分子(即所謂穿梭載體，shuttle vector)含有腺病毒左側(cè)的反向末端重復(fù)序列（LITR）、腺病毒包裝信號(hào)（ψ）等順式作用元件以及目的基因表達(dá)盒和腺病毒基因組的左端一段序列；另一個(gè)DNA分子（即骨架載體，backbone vector）與第一個(gè)DNA分子的3′端略微重疊，然后繼續(xù)向右，包含有大部分的病毒基因組序列。

兩種DNA分子共轉(zhuǎn)染入可以表達(dá)腺病毒E1區(qū)蛋白的細(xì)胞（如293、911以及PERC6等），并發(fā)生同源重組，即可得到預(yù)期的復(fù)制缺陷型重組腺病毒。其缺點(diǎn)是：容易受到親代病毒的污染，必須經(jīng)過2-3次的病毒空斑純化，并通過多次的嗜斑形成方法鑒定重組病毒。

另外，重組效率低下，重組腺病毒通常需要花費(fèi)兩周左右的時(shí)間。雖說如此，本方法是構(gòu)建腺病毒載體的經(jīng)典方法，目前應(yīng)用于臨床的腺病毒載體都是以這種方法構(gòu)建的。因此，若是構(gòu)建重組腺病毒的最終目標(biāo)是成功地應(yīng)用于臨床還是以這種方法為佳。

而且難度是相對(duì)的，對(duì)于一個(gè)在構(gòu)建重組腺病毒方面有著經(jīng)驗(yàn)豐富的實(shí)驗(yàn)室而言，以這種重組方法在較短的時(shí)間內(nèi)成功構(gòu)建出重組腺病毒并非很困難。

2. 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)

位點(diǎn)特異性重組(site-specific recombination)是發(fā)生在兩條DNA鏈特異位點(diǎn)上的重組，重組的發(fā)生需一段同源序列即特異性位點(diǎn)(又稱附著點(diǎn)attachment site)和位點(diǎn)特異性的蛋白因子即重組酶參與催化。

重組酶只能催化特異性位點(diǎn)間的重組,不能催化其它任何兩條同源或非同源序列之間的重組,因而重組具有特異性和高度保守性。據(jù)此，位點(diǎn)特異性重組又稱保守重組(conservation recombination)，該重組過程不需RecA酶參與。

目前應(yīng)用較多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系統(tǒng)，其中Cre、FLP和BP均為特異性重組酶，屬重組酶λ整合酶家族，它們催化的反應(yīng)類型、靶位點(diǎn)及重組機(jī)制十分相似，loxP、FRT和attBP為特異性位點(diǎn)，也有相似的結(jié)構(gòu)。我們將以Cre/loxP為例作一簡(jiǎn)要介紹。

Cre基因表達(dá)產(chǎn)物為343個(gè)氨基酸的單聚體蛋白，分子量為38kDa，它是位點(diǎn)特異性重組發(fā)生所需的特異性重組酶,其識(shí)別位點(diǎn)被稱為loxP(locus of crossing-over P1)，為一段34bp的DNA序列，由兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和一個(gè)8bp的不對(duì)稱間隔序列(又稱為核心序列)組成5′-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3′。

loxP位點(diǎn)堿基重排后形成十字形的結(jié)構(gòu)，核心序列形成一單鏈環(huán)，它為Cre重組酶切割的底物，也是DNA識(shí)別與重組的位點(diǎn)，對(duì)稱的13bp反向重復(fù)序列是Cre重組酶結(jié)合的序列。

位點(diǎn)特異性重組酶Cre很特別，由它介導(dǎo)的重組反應(yīng)不需要ATP或拓?fù)洚悩?gòu)酶等輔助因子的參與；重組反應(yīng)既可以發(fā)生于體內(nèi)、外的活細(xì)胞內(nèi)，也可以發(fā)生于無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)之中；重組反應(yīng)的底物形式多樣，無(wú)論是源于動(dòng)物、植物或微生物的DNA，還是線性、開環(huán)或超螺旋的DNA均適用。

Cre的特定作用位點(diǎn)loxP的位置也極富變化，可以位于相同或不同的染色體或DNA分子上，loxP之間既可同向排列、也可反向存在。

在同一個(gè)DNA分子上，Cre介導(dǎo)兩個(gè)同向排列l(wèi)oxP位點(diǎn)之間的DNA的缺失反應(yīng)(在DNA分子上留下一個(gè)loxP位點(diǎn))，被切除的DNA分子呈環(huán)狀。如果該環(huán)狀結(jié)構(gòu)具有質(zhì)粒的基本元件和抗性基因，則可在用其轉(zhuǎn)化大腸桿菌后形成抗性菌落。

如果兩個(gè)loxP位點(diǎn)反向排列，Cre則誘發(fā)倒位反應(yīng)。在不同的DNA分子上，Cre則介導(dǎo)缺失、重復(fù)、插入以及易位等反應(yīng)。

Cre/LoxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)也是由穿梭載體和骨架載體構(gòu)成，各含有一個(gè)同向排列的LoxP位點(diǎn)，其中骨架載體還含有由CMV啟動(dòng)子調(diào)控的Cre基因。將穿梭載體與骨架載體共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞株（293、911以及PERC6等），骨架載體所攜帶的Cre基因開始表達(dá)，介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的重組，剪切掉骨架載體上的細(xì)菌內(nèi)復(fù)制元件、抗性基因以及Cre基因，同時(shí)完成目的基因的插入。

由于骨架載體雖然攜帶有大部分的腺病毒基因組DNA卻缺少形成有感染能力腺病毒顆粒所必需的包裝信號(hào)（ψ），而穿梭載體則剛好相反，因此只有在兩個(gè)載體之間發(fā)生了重組，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重組腺病毒顆粒。通過這種方法轉(zhuǎn)染7~10天后就能觀察到病毒噬菌斑。

這種方法比前一方法獲得重組腺病毒的效率要高很多（約100倍），而且只要插入的外源基因不大于8Kb，那么幾乎100%的重組腺病毒都攜帶有目的基因。不難看出，這是一種非常便捷的腺病毒重組方法，非常適用于在構(gòu)建重組腺病毒載體方面經(jīng)驗(yàn)較少的實(shí)驗(yàn)室。

最近，由BD公司推出了一套在體外利用Cre/LoxP位點(diǎn)特異性重組構(gòu)建腺病毒載體的系統(tǒng)。該系統(tǒng)也是由一大（受體）一小（供體）兩個(gè)質(zhì)粒載體構(gòu)成。

供體載體包含兩個(gè)LoxP位點(diǎn)，分別位于多克隆位點(diǎn)的5′端和氯霉素抗性基因（Cmr）開放閱讀框的5′端，另外還含有氨芐抗性基因（Ampr）和蔗糖酶B基因（SacB），前者用于在大腸桿菌中保持載體遺傳性狀的穩(wěn)定，后者在重組后作負(fù)性選擇之用。

受體載體含有一個(gè)LoxP位點(diǎn)，緊隨其后的是一個(gè)可以在 Cre/LoxP介導(dǎo)重組后調(diào)控Cmr表達(dá)的細(xì)菌啟動(dòng)子。三個(gè)LoxP位點(diǎn)為同向排列，在Cre酶的作用下同時(shí)發(fā)生多個(gè)重組反應(yīng)，一部分重組反應(yīng)將目的基因和Cmr轉(zhuǎn)移到受體載體中。

由于供體載體及其衍生物（由一些意外重組事件產(chǎn)生）中都含有SacB基因，在含蔗糖的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，而受體載體及其衍生物在含氯霉素的培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，因此將重組反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α并鋪LB/Cm/蔗糖平板后，只有正確的重組子可以生長(zhǎng)。

將正確的腺病毒重組子用PacI酶消化，暴露其反向末端重復(fù)序列，轉(zhuǎn)染低代293細(xì)胞，經(jīng)過7~10天即可得到攜帶有目的基因的重組腺病毒。

這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：①酶切與連接步驟少；②正確的重組機(jī)率高，可達(dá)90%以上；③無(wú)需反復(fù)空斑純化。

3. 細(xì)菌內(nèi)同源重組（AdEasyTM System）

這種方法的基本策略是：在大腸桿菌內(nèi)通過同源重組的方法構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒載體，經(jīng)酶切線性化后再轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞系（293、911以及PERC6等），從而得到腺病毒感染顆粒。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞比較，在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行挑克隆、鑒定等操作無(wú)疑要便利許多，因此這種方法已被國(guó)內(nèi)許多實(shí)驗(yàn)室所采用。

然而，由于在大腸桿菌中腺病毒序列的遺傳選擇壓力較小，發(fā)生突變導(dǎo)致腺病毒活力下降的可能性就大大高于前面提到的真核細(xì)胞內(nèi)重組的方法。這種方法的共同特點(diǎn)是：

重組系統(tǒng)由兩種質(zhì)粒組成，一種是包含有全部（或右側(cè)大部分）腺病毒基因組DNA的大質(zhì)粒（骨架質(zhì)粒）；另一種是小的穿梭質(zhì)粒，其帶有目的基因表達(dá)盒以及在表達(dá)盒兩側(cè)的與大質(zhì)粒上的目的基因擬插入部位同源的序列（左、右臂 Left Right Arm）。

這種方法通常的操作流程是：首先，將目的基因亞克隆到穿梭載體中，經(jīng)過一個(gè)在穿梭載體左右臂之間的稀有的限制性內(nèi)切酶消化，暴露其左右臂；然后，與環(huán)化（或超螺旋）的骨架質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)化RecA酶陽(yáng)性的大腸桿菌（如BJ5183），使二者發(fā)生同源重組，得到攜帶目的基因的腺病毒重組子質(zhì)粒；

再后，用另一稀有的限制性內(nèi)切酶充分消化腺病毒重組子質(zhì)粒，切除質(zhì)粒上的原核細(xì)胞內(nèi)復(fù)制元件及抗性基因等，使其線性化并暴露左右末端重復(fù)序列（ITR）；最后，轉(zhuǎn)染腺病毒包裝細(xì)胞系（293、911以及PERC6等），得到腺病毒感染顆粒。以AdEasyTM系統(tǒng)為例，構(gòu)建流程如下：

AdEasyTM系統(tǒng)是由TONG-Chuan He博士等（1998）構(gòu)建的用來代替?zhèn)鹘y(tǒng)腺病毒重組系統(tǒng)的一個(gè)快捷系統(tǒng)。該系統(tǒng)的特點(diǎn)是：

1)有多種穿梭載體可供選擇（pShuttle、 pShuttle-CMV、pTrack、和pTrack-CMV）。其中pTrack和pTrack-CMV攜帶有報(bào)告基因EGFP（綠色熒光蛋白），轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后可于熒光顯微鏡下直接挑選陽(yáng)性克隆，非常直觀、簡(jiǎn)便。

2)酶切和連接反應(yīng)少，減化了操作步驟。

3)通過上面的流程圖不難看出，當(dāng)骨架質(zhì)粒與線性化的穿梭質(zhì)粒發(fā)生同源重組后，其抗性基因?qū)⒂稍瓉淼陌逼S抗性轉(zhuǎn)變?yōu)榭强剐裕旁氡鹊玫矫黠@的提高。
4) E.coli BJ5183內(nèi)的RecA酶是一種高效的同源重組酶，正確的同源重組率在60%以上。

不足之處在于：該系統(tǒng)中的骨架載體需以超螺旋的形式（需經(jīng)超速離心純化才能獲得）與線性化的穿梭質(zhì)粒一起點(diǎn)穿孔轉(zhuǎn)化E.coli BJ5183，才可以保證有較高的同源重組機(jī)率，這對(duì)于國(guó)內(nèi)一些設(shè)備和技術(shù)相對(duì)落后的實(shí)驗(yàn)室而言無(wú)疑是有一定的難度的。

另外如前所述，由于在大腸桿菌中腺病毒序列的遺傳選擇壓力較小，發(fā)生突變導(dǎo)致腺病毒活力下降的可能性就大大高于前面提到的真核細(xì)胞內(nèi)重組的方法，因此應(yīng)多挑選幾個(gè)重組子克隆轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并從中選出重組病毒活力強(qiáng)、目的基因表達(dá)量高的克隆用于實(shí)驗(yàn)。

我實(shí)驗(yàn)室在對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行了一些改進(jìn)后，使其更方便易行，更適合我國(guó)國(guó)情，并取得了較好的效果。具體步驟見實(shí)驗(yàn)操作部分。

4. 酶切連接

本方案的基本思路實(shí)在腺病毒質(zhì)粒中通過連接反應(yīng)插入一個(gè)表達(dá)盒，而不是進(jìn)行同源重組。這個(gè)系統(tǒng)中也含有穿梭和骨架兩種載體。大質(zhì)粒含有除E1和/或E3區(qū)外的全部腺病毒基因組，其E1區(qū)缺失部位有兩個(gè)非常罕見的由內(nèi)含子編碼的核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)（如，PI-Sce I和I-Ceu I）。

穿梭載體較小、易于操作，用于將目的基因表達(dá)盒亞克隆到腺病毒骨架質(zhì)粒載體中，在穿梭載體多克隆位點(diǎn)的兩側(cè)也含有上述特殊的酶切位點(diǎn)。首先將目的基因表達(dá)盒插入到穿梭載體中，用上述兩種酶消化之.

得到含有目的基因表達(dá)盒的穿梭載體片段與腺病毒骨架質(zhì)粒（用兩種酶預(yù)消化后）連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α即可得到腺病毒重組子克隆，將其用PacI消化暴露其反向末端重復(fù)序列后轉(zhuǎn)染低代293細(xì)胞，得到帶有目的基因表達(dá)盒的重組腺病毒。

這種方法的優(yōu)點(diǎn)是：克隆的效率可達(dá)90%，整個(gè)重組過程僅需10~17天即可完成；只用一種相同的大腸桿菌株，質(zhì)粒的構(gòu)建和擴(kuò)增很迅捷；產(chǎn)生以外重組事件和產(chǎn)生非感染性病毒DNA的幾率比前述的細(xì)菌內(nèi)同源重組的方法要更小一些。

不足之處在于：首先，正如我們前面提到的，由于在大腸桿菌中腺病毒序列的遺傳選擇壓力較小，發(fā)生突變導(dǎo)致腺病毒活力下降的可能性要高于真核細(xì)胞內(nèi)重組的方法；其次，兩種罕見酶PI-Sce I和I-Ceu I的價(jià)格昂貴，PacI也非常貴，因此這種方法的成本較高。