食品微生物檢驗GB4789.3-2016大腸菌群計數及注意事項
一、大腸菌群定義和衛生學意義
大腸菌群定義：在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌。大腸菌群不是細菌學上分類命名，它不代表某一種或某一屬的細菌，而是一組與糞便污染有關的細菌。這群細菌包括：埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、產氣克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬（又叫產氣桿菌屬，包括陰溝腸桿菌和產氣腸桿菌）和等。
衛生學意義：大腸菌群作為糞便污染的指標菌評價樣品中是否受到糞便的污染。表示了對人體健康是否具有潛在的危險性。直接反映了樣品受糞便污染的的程度。
二、GB4789.3-2016大腸菌群MPN法
1. 什么是MPN法？
?MPN法是統計學和微生物學結合的一種定量檢測法。待測樣品經系列稀釋并培養后,根據其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應用統計學概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數。
?MPN值并不能表示實際菌落數， 實際菌落數有可能落在置信區間內的任何一點，MPN值是落在這個置信區間內概率最大的一點。
?靈敏度較高，適用于污染菌落較少的樣品。
2. 大腸菌群MPN計數的檢驗操作
3. 培養基原理解析
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）
?月桂基硫酸鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長，胰蛋白胨提供碳源和氮源滿足細菌生長的需求；氯化鈉可維持均衡的滲透壓；乳糖是大腸菌群可發酵的糖類；磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀是緩沖劑。
?36±1℃培養24h后若已產氣，則可停止培養。如果沒有觀察到有產氣的現象，則繼續培養至48±2h。
?如接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯。- +
煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）
?膽鹽與煌綠均能抑制革蘭氏陽性菌生長。
?培養基配方當中含有膽鹽，大腸菌群發酵乳糖所產的酸會與膽鹽發生反應，形成膽酸沉淀。培養基可由原來的綠色變為黃色。
4. 大腸菌群最大可能數（MPN）報告
?確證的大腸菌群BGLB陽性管數，檢索MPN表，報告每1g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。
?當實驗結果在MPN表中無法查找到MPN值時，如：陽性管數為122，123，232，233等時，建議增加稀釋度（可做4~5個稀釋度），使樣品最高稀釋度能達到陰性終點(如果污染程度不能判定，則多加一稀釋度），然后再遵循相關的規則進行查找，最終確定MPN值。
三、GB4789.3-2016大腸菌群計數平板法
1. 大腸菌群平板計數法流程圖
2. 培養基原理解析
結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
?配方中膽鹽和結晶紫抑制革蘭氏陽性菌，中性紅作為指示劑，在酸性條件下為紫紅色。
?大腸菌群分解乳糖所產的酸與膽鹽結合，可形成粉紅色菌落菌落周圍有膽酸鹽沉淀環。
?該培養基無需高溫高壓滅菌，現配現用。
3. 計數典型和可疑菌落數
結果判讀：選取菌落數在15 CFU～150 CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環，菌落直徑為0.5 mm或更大。
證實試驗：從各樣品中接種同一樣品濃度的VRBA平板上共挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB肉湯管內，36℃±1℃培養24 h～48 h，觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。
4. 大腸菌群平板計數的報告
?經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數的平板菌落數,再乘以稀釋倍數,即為每g(mL)樣品中大腸菌群數。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。
?若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無菌落生長，則小于1乘以最低稀釋倍數計算。
四、質量控制
1. 實驗室過程中，每批樣品稀釋液都要做空白對照。
2. 為了控制環境污染，每次檢驗過程中，于檢驗臺上打開兩塊計數瓊脂平板，并在檢驗環境中暴露不少于15分鐘，將此平板與本批次樣品同時進行培養，以掌握檢驗過程中是否存在來自檢驗環境的污染。
3. 定期使用大腸埃希氏菌ATCC25922或相應定量活菌參考品，在P2實驗室或陽性對照實驗室內，用適當的食品樣品進行陽性實驗驗證，并進行記錄，次驗證實驗至少每2個月進行1次。
五、大腸菌群測試片法
1. 原理：大腸菌群檢測片由輕便防水紙質材料做支撐，其上覆蓋干燥培養基層（營養物質、凝固劑、選擇抑制劑、顯色劑）和透明隔水膜組成，經輻照滅菌。可用于食品、飲料等的大腸菌群計數。含有四氮唑指示劑菌落為紅色，發酵乳糖產酸和產氣。
2. 特點優勢
?菌落計數特別方便（容易判讀），紅色菌落，易于食品顆粒分開，無菌落重疊現象；
?菌落分布特別均勻；
?避免了培養基對細菌熱損傷有關；
?菌落蔓延或半透明菌膜現象很少發生
?經濟環保 無粉塵，體積小，重量輕，易儲運
?保質期長干制無水培養基，性質穩定，保質期更長
六、所需培養基試劑和質控菌株
用途 | 名稱 |
樣品稀釋 | 生理鹽水 |
磷酸鹽緩沖液（PBS） | |
磷酸鹽緩沖液（PBS） | |
磷酸鹽緩沖液（PBS） | |
生理鹽水 | |
MPN法計數初發酵試驗 | 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） |
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯(LST) | |
月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST） | |
雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯 | |
平板計數 | 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） |
結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA） | |
結晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板 | |
MPN法復發酵和平板計數證實 | 煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） |
煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB) | |
煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB） | |
HANDYPLAT微生物測試片 | 大腸菌群測試片 |
Q-Strain定量質控菌株 | 大腸埃希氏（ATCC25922） |
大腸埃希氏菌（ATCC25922） |
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