人肽聚糖(PG)ELISA試劑盒的應用
一、背景
人肽聚糖(PG)ELISA試劑盒用于測定血清，血漿及相關液體樣本中肽聚糖(PG)相關含量或活性。
原理：試劑盒采用間接法酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。往預先包被肽聚糖(PG)捕獲抗原的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的肽聚糖(PG)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。
二、樣本要求
1）血清
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
（2）血漿
應根據標本的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。
（3）尿液
用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照此實行。
（4）細胞培養上清
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。
三、操作步驟
1、從室溫平衡60min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2、設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3、待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；
4、隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5、棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6、每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7、每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。
四、應用
用于脂多糖/肽聚糖誘導人血小板凋亡的體外研究：
通過制備人的洗滌血小板,并在TLR4/TLR2單克隆抗體阻斷前后分別給予LPS/PGN刺激,初步探討體外條件下LPS/PGN對血小板凋亡的誘導效應及LPS-TLR4、PGN-TLR2通路在其中發揮的作用,為膿毒癥相關性血小板減少癥的發病機制提供基礎研究證據,為改善膿毒癥相關性血小板減少癥患者的預后提供可能的治療靶點。
體外條件下,LPS誘導人血小板凋亡的研究及TLR4的介導作用制備人洗滌血小板,濃度梯度組用不同濃度的LPS分別與洗滌血小板進行體外孵育,觀察LPS對血小板凋亡的誘導效應并篩選出誘導血小板凋亡的LPS最適濃度。TLR4單克隆抗體阻斷組以凝血酶為陽性對照,觀察TLR4單克隆抗體阻斷前后,LPS對血小板凋亡誘導作用的變化。
體外條件下,PGN誘導人血小板凋亡的研究及TLR2的介導作用制備人洗滌血小板,濃度梯度組用不同濃度的PGN分別與洗滌血小板進行體外孵育,觀察PGN對血小板凋亡的誘導效應并篩選出誘導血小板凋亡的PGN最適濃度。TLR2單克隆抗體阻斷組以凝血酶為陽性對照,觀察TLR2單克隆抗體阻斷前后,PGN對血小板凋亡誘導作用的變化。
方法：制備洗滌血小板,建立體外反應體系,分別設置LPS/PGN濃度梯度實驗組及TLR4/TLR2單克隆抗體阻斷實驗組,以凝血酶誘導的血小板凋亡作為陽性對照,應用流式細胞技術測定不同處理組血小板的PS外翻及ΔΨ去極化,應用凋亡蛋白抗體芯片法篩查血小板凋亡相關蛋白的表達水平,應用蛋白印記技術檢測促凋亡蛋白Caspase-3、-8、Bax、Bak和抗凋亡蛋白Bcl-2的表達水平。
結果：LPS及PGN均以濃度依賴性為特點誘導血小板發生PS外翻及ΔΨ去極化。凋亡蛋白抗體芯片結果顯示,在LPS及PGN刺激下,血小板多種凋亡相關蛋白的表達發生變化,主要以促凋亡蛋白的升高及抗凋亡蛋白的降低為主。WesternBlot結果提示LPS及PGN誘導下,血小板促凋亡蛋白Caspase-3、-8、Bax及Bak的表達增加,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達也呈增高趨勢。
而TLR4/TLR2單克隆抗體阻斷實驗表明,LPS-TLR4/PGN-TLR2通路至少部分介導了LPS/PGN誘導的血小板凋亡的發生。
結論：1、LPS及PGN均可誘導血小板發生凋亡,表現為PS外翻、ΔΨm去極化、Caspase-3活性增高、Caspase-8、Bak、Bax及Bcl-2等凋亡相關蛋白表達增高;
2、內源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑均參與了LPS/PGN誘導的血小板凋亡;
3、TLR4參與了LPS誘導的血小板凋亡的發生,TLR4單克隆抗體至少可以部分阻斷LPS誘導的血小板凋亡;TLR2參與了PGN誘導的血小板凋亡的發生,TLR2單克隆抗體至少可以部分阻斷PGN誘導的血小板凋亡。
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