實時熒光定量PCR（realtime PCR）

實驗方法原理

實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。

實驗步驟

一、 樣品RNA的抽提

1.  取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

2.  兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

3.  RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12 000 rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

4.  RNA清洗 移去上清液，每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混勻后，4℃下7 000 rpm離心5分鐘。

5.  RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

6.  溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

二、 RNA質量檢測

1.  紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

 （1）濃度測定

A₂₆₀下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A₂₆₀ x 稀釋倍數 x 40 ug/ml。具體計算如下：

RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul，1:100稀釋至495 ul的TE中，測得A₂₆₀ = 0.21

RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul

取5 ul用來測量以后，剩余樣品RNA為35 ul，剩余RNA總量為：

35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

（2）純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

2.  變性瓊脂糖凝膠電泳測定

（1）制膠

1 g瓊脂糖溶于72 ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS電泳緩沖液

濃度  成分

0.4 M  MOPS，pH 7.0

0.1 M  乙酸鈉

0.01 M  EDTA

灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

（2）準備RNA樣品

取3 ugRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

（3）電泳

上樣前凝膠須預電泳5 min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。

（4）紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

三、樣品cDNA合成

1.  反應體系

序號          反應物           劑量

1          逆轉錄buffer       2 ul

2         上游引物              0.2 ul

3         下游引物              0.2 ul

4          dNTP                   0.1 ul

5       逆轉錄酶MMLV     0.5 ul

6         DEPC水              5 ul

7          RNA模版            2 ul

8           總體積               10 ul

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

2.  混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5 ul，37℃水浴60分鐘。

3.  取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR

1.  β-actin陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為10¹¹，反應前取3 μl按10倍稀釋（加水27 ul并充分混勻）為10¹⁰，依次稀釋至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴，以備用。

2.  反應體系如下：

標準品反應體系

序號           反應物                           劑量

1       SYBR Green 1 染料             10 ul

2       陽性模板上游引物F              0.5 ul

3      陽性模板下游引物R              0.5 ul

4                 dNTP                            0.5 ul

5                 Taq酶                           1 ul

6           陽性模板DNA                    5 ul

7              ddH₂O                            32.5 ul

8               總體積                            50 ul

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

3.  管家基因反應體系：

序號            反應物                                劑量

1      SYBR Green 1 染料                   10 ul

2      內參照上游引物F                         0.5 ul

3     內參照下游引物R                         0.5 ul

4               dNTP                                    0.5 ul

5               Taq酶                                   1 ul

6      待測樣品cDNA                             5 ul

7              ddH₂O                                  32.5 ul

8             總體積                                    50 ul

輕彈管底將溶液混合， 6000 rpm短暫離心。

3.  制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。

五、 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的DNA模板

1.  針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。

2.  反應體系

序號                     反應物                        劑量

1                     10× PCR緩沖液            2.5 ul

2                           MgCl2 溶液              1.5 ul

3                           上游引物F                 0.5 ul

4                           下游引物R                0.5 ul

5                            dNTP混合液            3 ul

6                            Taq聚合酶               1 ul

7                             cDNA                       1 ul

8                    加水至總體積為               25 ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個PCR循環（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。

（3）PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

（4）將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×10¹⁰，依次稀釋至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴幾個濃度梯度。

六、 待測樣品的待測基因實時定量PCR
1.  所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。

2.  體系配置如下：

序號             反應物                                劑量

1            SYBR Green 1 染料               10 ul

2                上游引物                               1 ul

3                下游引物                               1 ul

4                  dNTP                                   1 ul

5              Taq聚合酶                               2 ul

6             待測樣品cDNA                        5 ul

7                   ddH2O                              30 ul

8                   總體積                               50 ul

輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心。

（3）將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃ 2分鐘預變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環，最后72℃7分鐘延伸。

七、 實時定量PCR使用引物列表

引物設計軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構；引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。

八、電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

注意事項

1.熒光閾值：在熒光擴增曲線指數增長長期設定一個熒光強度標準（即PCR擴增產物量標準）。熒光閾值可設定在指數擴增階段任意位置上，但實際應用要結合擴增效率，線性回歸系數等參數來綜合考慮。

2.Ct值：在PCR擴增過程中，擴增產物（熒光信號）到達閾值時所經過的擴增循環次數。Ct值具有極好的重復性。

其他

實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統定量只能終點檢測的局限，實現了每一輪循環均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：

1）Ct值的重現性PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。

外標準曲線的定量方法相比內標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。

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