用紙層析法鑒定轉氨酶的轉氨基作用
【基本原理】
轉氨基作用廣泛地存在于機體各組織器官中，是體內氨基酸代謝的重要途徑。氨基酸反應時均由專一的轉氨酶催化，此酶催化氨基酸的α－氨基轉移到另一α－酮基酸上。各種轉氨酶的活性不同，其中肝臟的谷丙轉氨酶（Glutamic Pyruvic Transaminase ,GPT）活性較高，它催化如下反應：
α—酮戊二酸 + 丙氨酸 谷氨酸 + 丙酮酸
本實驗以丙氨酸和α-酮戊二酸為底物，加肝勻漿保溫后，用紙層析法檢查谷氨酸的出現，以證明轉氨基作用。
紙層析屬于分配層析。以濾紙為支持物，濾紙纖維與水親合力強，能吸收20~22 %的水。而且其中6~7 %的水是以氫鍵形式與纖維素的羥基結合，在一般情況下很難脫去，而濾紙纖維與有機溶劑的親和力甚弱。所以紙層析是以濾紙纖維結合水作為固定相，以有機溶劑作為流動相。
在用紙層析法分離氨基酸時，由于各種氨基酸在此二相中的分配系數不同，各有一定的遷移率。極性弱的氨基酸，易溶于有機溶劑即分配系數小，隨流動相移動較快，Rf值大；而極性強的氨基酸相反，據此可以分離鑒定氨基酸。
本實驗用圓濾紙進行水平型層析，除待測液外，點加對照液和標準液，層析后用茚三酮法顯色，對此觀察色斑，判定結果。
【器材】
玻璃勻漿器、離心管、10ml試管、培養皿、表面皿、沸水浴鍋、37℃恒溫水浴箱、10cm圓濾紙、吹風機、手術剪刀。
【試劑】
1．0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液。
2．0.2mol/L Na2HPO4溶液81ml與0.2mol/L NaH2PO4溶液19ml混勻,用蒸餾水稀釋20倍。
3．0.1mol/L丙氨酸溶液
稱取丙氨酸0.891克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中,以1.0 N NaOH仔細調至pH7.4后, 加磷酸鹽緩沖液至100ml。
4． 0.1mol/Lα－酮戊二酸
稱取α－酮戊二酸1.461克,先溶于少量0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 N NaOH仔細調至pH 7.4 后，加磷酸鹽緩沖液至100ml。
5．0.1mol/L 谷氨酸溶液
稱取谷氨酸0.735克,先溶于少量0.01mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖液中，以1.0 N NaOH仔細調至pH 7.4 后, 加磷酸鹽緩沖液至50 ml。
6．0.5%茚三酮溶液
稱取茚三酮0.5克于100 ml丙酮中溶解。
7．層析溶劑
酚：水= 4：1（V/V）混勻備用。現用現配。
【基本操作】
1．勻漿制備：取新鮮動物肝0.5克,剪碎后放入勻漿器,加入冷0.01mol/LpH 7.4磷酸鹽緩沖液1.0 ml,迅速研成勻漿,用上述緩沖液3.5ml混勻備用。
2．酶促反應過程
（1）取離心管兩支，編號：1（測定管）、2（對照管），各加肝勻漿0. 5ml。把對照管放沸水浴中加熱5分鐘，取出冷卻。
（2）各加0.1mol/L丙氨酸0.5 ml, 0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5 ml,0.01mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液1.5 ml,搖勻。
（3）37℃保溫，1小時后取出。
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