蛋白質的沉淀反應、顏色反應、兩性反應、電荷及等電點的測定
一、實驗目的
1.熟悉蛋白質的沉淀反應、顏色反應和兩性反應及其機理。
2.掌握蛋白質等電點的測定方法及其原理。
3.掌握蛋白質電荷的測定方法及其機理。
二、實驗原理
(一)蛋白質的沉淀反應原理
蛋白質的水溶液是一種比較穩定的親水膠體，這是因為蛋白質顆粒表面帶有很多極性基團，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度親和性，當蛋白質與水相遇時，就很容易被蛋白質吸住，在蛋白質顆粒外面形成一層水膜(又稱水化層)。水膜的存在使蛋白顆粒相互隔開，顆粒之間不會碰撞而聚成大顆粒。因此蛋白質在溶液中比較穩定而不會沉淀。蛋白質能形成較穩定的親水膠體的另一個原因，是因為蛋白質顆粒在非等電狀態時帶有相同電荷，使蛋白質顆粒之間相互排斥，保持一定距離，不致相互凝集沉淀。
蛋白質由于帶有電荷和水膜，因此在水溶液中形成穩定的膠體。當某些物理化學因素破壞了蛋白質的水膜或中和了蛋白質的電荷，則蛋白質膠體溶液就不穩定而出現沉淀現象。 蛋白質可因加入下列試劑而產生沉淀：
1.加鹽類如硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等可以破壞蛋白質膠體周圍的水膜，同時又中和了蛋白質分子 的電荷，因此使蛋白質產生沉淀，這種加鹽使蛋白質沉淀析出的現象稱鹽析。鹽析法是分離制備蛋白質的常用方法，不同蛋白質鹽析時所需的鹽濃度不同，因此調節鹽濃度，可使混合蛋白質溶液中的幾種蛋白質分段析出，這種方法叫做分段鹽析。但中性鹽并不破壞蛋白質的分子結構和性質，因此，若除去或降低鹽的濃度，蛋白質就會重新溶解。
2.加有機溶劑如酒精、丙酮等可使蛋白質產生沉淀，這是由于這些有機溶劑和水有較強的作用，破壞了蛋白質分子周圍的水膜，因此發生沉淀作用。若及時將蛋白質沉淀與丙酮或乙醇分離，蛋白質沉淀則可重新溶解于水中。
3.重金屬鹽如氯化汞、硝酸銀、醋酸鉛及三氯化鐵等。這是因為蛋白質在堿性溶液中帶負離子，可與這些重金屬的正離子作用而生成不易溶解的鹽而沉淀。
4.某些酸類如苦味酸、單寧酸、三氯乙酸等能和蛋白質化合成不溶解的蛋白質鹽而沉淀。
用鹽析法或低溫下加入丙酮、乙醇使蛋白質沉淀，以及利用等電點的沉淀反應時，雖然蛋白質已經沉淀析出，然而其分子內部結構并沒發生明顯的改變，仍保持原有的生物活性。如除去沉淀因素，蛋白質可重新溶解在原來的溶劑中。因此，這種沉淀作用稱為可逆沉淀作用。但如在溫度較高情況下加入有機溶劑來沉淀分離蛋白質或已用有機溶劑沉淀分離得到的蛋白質沒有及時與有機溶劑分開，都會引起蛋白質的性質發生改變，這應該注意。
(二)蛋白質的顏色反應原理
蛋白質分子中的某些基團與顯色劑作用，可產生特定的顏色反應，不同蛋白質所含氨基酸不完全相同，顏色反應亦不同。顏色反應不是蛋白質的專一反應，一些非蛋白物質亦可產生相同顏色反應，因此不能僅根據顏色反應的結果決定被測物是否是蛋白質。顏色反應是一些常用的蛋白質定量測定的依據。重要的顏色反應有：
1.雙縮脲反應
將尿素加熱到180℃，則兩分子尿素縮合而成一分子雙縮脲，并放出一分子氨。雙縮脲在堿性溶液中能與硫酸銅反應產生紅紫色絡合物，此反應稱雙縮脲反應。蛋白質分子中含有許多和雙縮脲結構相似的肽鍵，因此也能起雙縮脲反應，形成紅紫色絡合物。通常可用此反應來定性鑒定蛋白質，也可根據反應產生的顏色在540nm 處比色，定量測定蛋白質。
2.蛋白質的黃色反應
是含有芳香族氨基酸特別是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白質所特有的呈色反應。蛋白質溶液遇硝酸后，先產生白色沉淀，加熱則白色沉淀變成黃色，再加堿顏色加深呈橙黃色，這是因為硝酸將蛋白質分子中的苯環硝化，產生了黃色硝基苯衍生物。例如皮膚、指甲和毛發等遇濃硝酸會變成黃色。
3.米倫氏反應
米倫試劑為硝酸汞、亞硝酸汞、硝酸和亞硝酸的混合物，蛋白質溶液加入米倫試劑后即產生白色沉淀，加熱后沉淀變成紅色。酚類化合物有此反應，酪氨酸含有酚基，故酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白質都有此反應。
4.茚三酮反應
蛋白質與茚三酮共熱，則產生藍紫色的還原茚三酮、茚三酮和氨的縮合物。此反應為一切氨基酸及α-氨基酸所共有。含有氨基的其他物質亦呈此反應。
5.乙醛酸反應
在蛋白質溶液中加入乙醛酸，并沿管壁慢慢注入濃硫酸，在兩液層之間就會出現紫色環，凡含有吲哚基的化合物都有這一反應。色氨酸及含有色氨酸的蛋白質有此反應，不含色氨酸的白明膠就無此反應。
6.坂口反應
精氨酸分子中含有胍基，能與次氯酸鈉(或次溴酸鈉)及α-萘酚在氫氧化鈉溶液中產生紅色產物。此反應可以用來鑒定含有精氨酸的蛋白質，也可用來定量測定精氨酸含量。
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