轉化(Transformation)
轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。
轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理后,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞(Compenent cells)。進入受體細胞的DNA分子通過復制,表達實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子(Transformant,即帶有異源DNA分子的受體細胞)。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態細胞轉化效率較高,但CaCl2 法簡便易行,且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求,制備出的感受態細胞暫時不用時,可加入占總體積15％的無菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法為使用更廣泛。
為了提高轉化效率, 實驗中要考慮以下幾個重要因素：
1. 細胞生長狀態和密度: 不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600 來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時,細胞密度在5×107 個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。
2. 質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5％。
3. 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。
4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。
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