葡聚糖凝膠層析脫鹽
一. 目的
學(xué)習(xí)凝膠層析的工作原理和操作方法
掌握利用葡聚糖凝膠層析進(jìn)行蛋白質(zhì)脫鹽的技術(shù)
二. 原理
凝膠層析又稱凝膠過濾或排阻層析。凝膠過濾的主要裝置是填充有層析介質(zhì)的層析柱 。
1. 層析介質(zhì)的特點(diǎn)
（1）遇水為不溶解的固相；
（2）是化學(xué)惰性物質(zhì)；
（3）離子基團(tuán)含量少；
（4）顆粒大小和網(wǎng)眼均勻；
（5）機(jī)械強(qiáng)度較強(qiáng)；
（6）具有可選擇的多種孔徑。
目前使用較多的是葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂 糖凝膠及其衍生物。尤其葡聚糖凝膠（商品名稱Sephadex）是最常用的層析介質(zhì)。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷（ ）交聯(lián)成的具有三維結(jié)構(gòu)不溶于水的高分子 化合物。調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑配比，可以獲得網(wǎng)眼大小不同，型號各異的凝膠。當(dāng)葡聚糖分子量越小，交聯(lián)劑用量越大，則交聯(lián)度越大，凝膠網(wǎng)眼越小，吸水量越小，G值也越小。G值表示每克干膠吸水量（mL）的十倍。例如Sephadex G-25其吸水量應(yīng)為2.5mL/g干膠。常用的葡聚糖凝膠有多種規(guī)格，如G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100等。實(shí)驗(yàn)中選用何種型號應(yīng)根據(jù)被分離的混合物分子的大小及工作目的來確定（參見附錄五）。
2. 分離原理
當(dāng)混合樣液加到凝膠柱上，隨著洗脫劑而通過凝膠柱時(shí)，分子大小不同的物質(zhì)受到不同的阻滯作用。顆粒接近或大于網(wǎng)眼的分子，不能進(jìn)入凝膠的網(wǎng)眼中，在重力作用下它們隨著溶劑在凝膠顆粒之間沿較短流程向下流動，受到的阻滯作用小，移動速度快，先出層析柱（此現(xiàn)象叫作被排阻。被排阻的最小分子量稱為該規(guī)格凝膠的排阻極限）；而顆粒小于網(wǎng)眼的分子可滲入凝膠網(wǎng)眼之中，它們被洗脫時(shí)不斷地從一個網(wǎng)眼穿到另一個網(wǎng)眼，逐層擴(kuò)散，阻滯作用大，流程長，移動速度慢，因而后出層析柱。在層析柱的出口處，我們用多個試管分步收集洗脫液，就可將混合物中各組分彼此分離。
當(dāng)我們從生物組織中用鹽析法提取蛋白質(zhì)后，常需要進(jìn)行蛋白質(zhì)的脫鹽工作，我們可采用層析介質(zhì)為葡聚糖凝膠G-25（或G-15、G-50），用適當(dāng)?shù)南疵搫┻M(jìn)行洗脫，經(jīng)凝膠層析，就可以將大分子蛋白質(zhì)與小分子鹽類分離。
三. 實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備
1. 材料
含硫酸銨鹽的蛋白質(zhì)溶液
2. 器材
層 析 柱： 內(nèi)徑×柱高=1.0cm×25cm
滴定臺架、螺絲夾：各1
刻度試管： 10mL×14
移 液 管： 1mL×1
燒 杯： 250mL×1 50mL×1
滴 管： 2
洗 耳 球： 2
洗瓶、試管架、移液管架、玻棒：各1
四. 試劑的配制
1. 葡聚糖凝膠Ｇ-25(或G-15、G-50)
溶脹凝膠方法：按每個層析柱約4g的量稱取葡聚糖凝膠G-25于燒杯中，加過量蒸餾水于沸水浴中溶脹2小時(shí)或在室溫下溶脹6小時(shí)以上。用傾瀉法除去上層漂浮的細(xì)碎凝膠，重復(fù)3～4次。操作中避免劇烈攪拌，防止破壞其交聯(lián)結(jié)構(gòu)。
2. BaCl2溶液（1%）
3. 考馬斯亮藍(lán)G-250
稱取0.1g考馬斯亮藍(lán)G-250，先溶于50mL95%乙醇中，再加入85%的磷酸100mL，最后用蒸餾水定容到1000mL。暗處存放。
4. 脲（6mol/L）
5. 洗脫劑
應(yīng)依據(jù)被純化的蛋白質(zhì)的不同特性而選用不同的緩沖液。
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