原位雜交（in situ hybridization）
原位雜交（in situ hybridization）用特定標(biāo)記的已知堿基序列核酸作為探針與組織、細(xì)胞中待檢測(cè)核酸按堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則在原位進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，然后用與標(biāo)記物相應(yīng)的監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，通過(guò)免疫組織化學(xué)方法在被檢測(cè)核酸原位進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)核酸定位。原位雜交可根據(jù)檢測(cè)物而分為細(xì)胞內(nèi)和組織切片原位雜交；根據(jù)其用探針及檢測(cè)核酸的不同可分為DNA-DNA、RNA-DNA、RNA-RNA雜交。根據(jù)標(biāo)記方法不同可分為放射性探針和非放射性探針。
其基本方法包括：固定、切片、雜交、顯色等主要步驟。
(一)取材與標(biāo)本固定
1． 取材 對(duì)于原位雜交所用的材料要盡可能新鮮，為了防止RNA的降解，取材要迅速，取材后要盡快固定或冷凍保存。
2． 固定 進(jìn)行原位雜交的組織或細(xì)胞必須經(jīng)過(guò)固定處理，固定的目的是為了
①保持細(xì)胞形態(tài)原有結(jié)構(gòu)；
②最大限度保存細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA的水平；
③使探針易于進(jìn)入細(xì)胞或組織內(nèi)。
3． 固定液 常用固定液有10％甲醛、4％多聚甲醛、冰醋酸-酒精混合液、Bouin氏固定液等。這些固定液都有不同的優(yōu)缺點(diǎn)因此要根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)對(duì)象，選擇最佳的固定液。
4． 固定方法 組織標(biāo)本取材后，迅速放入固定液中2～4h，取材組織大小為1cm×1cm×0.5cm，不宜太大。必要時(shí)，動(dòng)物組織可進(jìn)行灌流固定，然后將組織按要求取材放入20%蔗糖中，4℃過(guò)夜，次日可行冰凍切片。
(二)切片及細(xì)胞標(biāo)本的制備
1． 載玻片的處理 因?yàn)樵浑s交一般在載玻片上進(jìn)行，所以載玻片必須保持清潔且不能有任何核酸酶的污染。一般載玻片可先經(jīng)洗衣粉浸泡過(guò)夜，用流水沖洗、酸中浸泡4～8h，再用流水沖洗，雙蒸水洗2～3次。在160℃烤箱中烘烤2～4h。亦可經(jīng)15磅高壓滅菌20min處理，可將載玻片上的核酸酶消除。
2． 組織切片與預(yù)處理
（1）冰凍切片：新鮮組織也可在取材后，直接置入液氮中迅速驟冷，冷凍切片后，4％多聚甲醛固定5～10min，也可保存在-70℃中待用。雜交前切片迅速恢復(fù)至室溫并干燥，0.1mol PBS洗三次，2×SSC洗10min，滴加預(yù)雜交液室溫孵育1h。
（2）石蠟切片：組織固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，可長(zhǎng)期保存，隨時(shí)用于原位雜交。雜交前切片經(jīng)①二甲苯脫蠟2次，每次10min；
②純酒精洗2次，每次5min；
③空氣干燥5min；
④梯度酒精復(fù)洗95％，80％，70％各1min；
⑤0.1 mol PBS洗3次，每次5min；
⑥2×SSC洗10min；
⑦滴加預(yù)雜交液于濕盒內(nèi)室溫孵育1h。
（3）培養(yǎng)細(xì)胞：每張載玻片滴加200μl濃度為1×105/m1的細(xì)胞懸浮液，空氣干燥1～2min制成細(xì)胞涂片，也可直接用培養(yǎng)細(xì)胞蓋片。上述細(xì)胞片經(jīng)酒精或多聚甲醛固定5min，其余步驟同冰凍切片。
(三) 試劑 配制
配制溶液過(guò)程中均需戴手套，液體配制均用超凈水，所用瓶子均經(jīng)160℃烘烤4h，主要目的是去除RNA酶。
1． DEPC水 將DEPC按1‰濃度加入超凈水中，充分混合后靜置過(guò)夜，15~20min高壓消毒，之后室溫避塵存放。
2． 0.1mol PBS pH 7.4
A液：0.1mol NaH2PO4為NaH2PO4 (MW：156.01，2H2O) 1.56g；DEPC水 100.00m1。
B液：0.1mol Na2HP04為Na2HPO4 (MW：358.14，12H2O) 17.907g；DEPC水 500.00m1。
A液：B液＝9.5∶40.5 加NaCl使其濃度達(dá)0.85％。
3． 20×SSC 為NaCl(3mol/L) 8.765g；Na3C6H50H2O7·2(0.3mol/L) 4.410g；DEPC水50.00m1。
4． 4％多聚甲醛(pH 7.4) 為多聚甲醛4g；0.1mol PBS 100m1。
5． 緩沖液
（1） 緩沖液Ⅰ(pH 7.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；消毒超凈水加至1000ml。
（2） 緩沖液Ⅱ(pH 9.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。
（3） 緩沖液 Ⅲ(pH 9.5) 為1mol Tris-HCl 100ml；1molEDTA 5ml；5mol NaCl 20ml；1molMgCI 50ml；消毒超凈水加至1000ml。
北京天優(yōu)?？瞪锟萍加邢薰?/span>
官網(wǎng)：http://www.jyzjsd.com/
服務(wù)熱線：400-860-6160
聯(lián)系電話/微信：13718308763
QQ:2136615612 3317607072
E-mail：Tianyoubzwz@163.com
