離子交換法分離氨基酸
一、實驗目的
學習用陽離子交換樹脂柱分離氨基酸的操作方法和基本原理。
二、實驗原理
離子交換層析 (ion exchange chromatography，簡稱ICE)是分析和制備樣品混合物的液-固相層析方法，是基于待測物質的陽離子或陰離子和相對應的離子交換劑間的靜電結合，即根據物質的酸堿性、極性等差異，通過離子間的吸附和脫吸附原理將電解質溶液各組分分開。它是從復雜混合物體系中分離性質極為相似的生物分子的有效手段之一。由于帶電荷不同的各種物質對離子交換劑有不同親和力，通過改變洗脫液的離子強度和pH值，控制這種親和力，即可使這些物質依據親和力大小順序依次從層析柱中洗脫下來。
氨基酸是兩性電解質，分子 上的凈電荷取決于氨基酸的等電點和溶液的pH值，各種氨基酸分子結構不同，在同一pH值時所帶電荷的性質(正、負)和多少不同，與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可根據親和力從小到大的順序被洗脫液分別洗脫下來，達到分離的效果。
三、儀器與試劑
(一)實驗器材
(1)玻璃層析柱
(2)試管
(3)移液管
(4)恒壓洗脫瓶
(5)部分收集器
(6)水浴鍋
(7)分光光度計
(8)電爐
(二)材料與試劑
(1)苯乙烯磺酸鈉型樹脂(100~200目)
(2)2mol/L鹽酸溶液
(3)2mol/L氫氧化鈉溶液
(4)標準氨基酸溶液：將天門冬氨酸和賴氨酸分別配成2mg/mL的0.1mol/L鹽酸溶液。
(5)混合氨基酸溶液：將上述天門冬氨酸和賴氨酸溶液按1：4比例混合。
(6)檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸溶液(pH5.8，鈉離子濃度0.45mol/L)：取檸檬酸14.25克、氫氧化鈉9.30克分別溶于水后混合，加入濃鹽酸5.25毫升，定容至500毫升;4℃冰箱保存。
(7)顯色劑：2克水合茚三酮溶于95%乙醇中，加水至100毫升。
四、操作步聚
(1)層析柱的準備：將強酸性陽離子交換樹脂用氫氧化鈉處理成Na+型后洗至中性，攪拌1小時后裝入層析柱，使之自然降沉到一定高度，用緩沖液平衡。
(2)平衡：用pH5.8的檸檬酸緩沖液沖洗平衡離子交換柱，調節流速，收集洗脫液至4倍床體積即可上樣。
(3)加樣分離：將液面緩慢放至貼近層析柱表面，由柱上端仔細加入氨基酸混合液0.25~0.5毫升，同時開始收集流出液。當樣品液彎月面靠近樹脂頂端時，立即加入0.5毫升檸檬酸緩沖液。待緩沖液彎月面靠近樹脂頂端時，再加入0.5毫升檸檬酸緩沖液。如此重復兩次，然后用滴管小心注入檸檬酸緩沖液(切勿攪動床面)。用試管收集洗脫液，每管收集1毫升，直至無氨基酸流出為止。
(4)氨基酸的鑒定：向各管收集液中加入1毫升水合茚三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中加熱15分鐘，冷至室溫測定光密度值。以收集的管數為橫坐標，以吸光度值A為縱坐標，繪制洗脫曲線。(用以已知兩種氨基酸的純溶液為樣品，按上述方法和條件分別操作，將得到的洗脫曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照，即可確定兩個峰為何種氨基酸。)
五、思考題
1.何謂氨基酸的離子交換?本實驗采用的離子交換劑屬于哪一種?
2.離子交換樹脂用緩沖液平衡，為何又用緩沖液沖洗?實驗中為什么要用pH5.8的檸檬酸緩沖液?可不可以用其它pH值的緩沖液?如果可以，應選用的pH為多少?并闡述原理。
3.茚三酮顯色劑在與氨基酸顯色時，是與氨基酸的什么基團反應?反應條件是什么?顯色時為什么要沸水浴加熱?顯色原理是什么?
4.本實驗分離的兩種氨基酸，是否可以采用陰離子交換樹脂分離，如果使用陰離子樹脂，條件和結果如何?請說明原理。
5.除氨基酸外，用離子交換柱層析法還適合分離哪些物質?為什么?
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